DOI: 10.1002/term.3100

开发儿科应用的组织工程化血管移植物（TEVGs）必须考虑与该患者群体相关的独特因素。虽然新生细胞的弹性形成潜能增加为克服体外弹性形成的长期挑战提供了机会，但新生儿患者对自体组织获取的耐受性较低，这就需要具有生长潜力的移植物。本研究的目的是应用多管齐下的策略，结合脐带衍生材料在功能性小儿TEVGs的制作中促进弹性生成。研究者进行了一项初步的概念验证研究，以从人脐带血样本中提取纤维蛋白原，通过静电纺丝制备纳米纤维蛋白原支架。将人脐带动脉平滑肌细胞（hUASMCs）植入支架，使用免疫荧光显微镜观察支架内新组织的形成。随后，使用聚己内酯（PCL）增强的猪血源纤维蛋白原支架（使用与脐带血纤维蛋白原相同的方案进行分离）开发了一种轧制薄板移植物，该移植物采用地形和生化指导线索来促进弹性生成和细胞定向。这种方法制备的TEVG具有强大的机械性能、细胞外基质（ECM）的仿生排列以及弹性纤维相关蛋白（EFRP）的丰富表达。本研究结果有助于进一步开发小儿TEVGs，探索支架微纳米结构对血管细胞功能和ECM生成的影响。

图1.电纺纤维蛋白原支架的表征。（A）显示电纺丝蛋白原TEVG支架的宏观图像。（B，C）细胞接种的人脐带衍生支架的免疫组织化学分析；（B）DAPI核复染的阴性染色对照（蓝色），（C）纤维蛋白原的阳性染色（红色）表明在电纺丝纤维蛋白原支架中检测到了目标表位。（D-F）（D）商业人、（E）脐带来源和（F）猪血来源的电纺纤维蛋白原支架的扫描电子显微照片。（G）电纺丝支架组内的平均纤维直径，根据SEM显微照片计算（n=6）。（H）电纺支架组的干支架模量，各组之间未检测到显著性差异。（I）经证实商业纤维蛋白原的极限抗张强度（UTS）比脐带或猪血源支架显著更高（p<0.05）。比例尺：B，C=50µm；D-F=5µm。

图2.脐带支架中的细胞和基质活性。（A-H）与hUASMC接种的脐带支架（B，D，F，H）相比，脐带动脉（A，C，E，G）中的基质蛋白表达。（GL）与hUASMC接种的脐带支架相比（J，L），脐带动脉（I，K）中的表型标志物表达。hUASMCs及其周围基质对I型胶原蛋白、α-SMA和弹性蛋白原呈阳性染色，而对弹性蛋白纤维、原纤维蛋白2或钙调蛋白则不适用。比例尺=50µm。

图3.猪血源纤维蛋白原支架中的新组织发育。（A，B）培养2和4周后的I型胶原蛋白染色。（C，D）培养2周和4周后，接种hUASMCs中的α-SMA表达。（E-H）培养4周后新组织中的弹性蛋白表达；（E）阴性对照，（F）弹性蛋白，（G）LOX，和（H）弹性蛋白。（I）培养4周后，支架的宏观外观显示出组织样质地。（J，K）支架的机械性能；从2周（n=5）至4周（n=3）培养期间，支架的杨氏模量（J）和UTS（K）显著增加。比例尺=50µm。

图4.纤维蛋白原基移植物的表征。（A）轧制薄板接枝的宏观图像。（B）SEM显微照片，显示了电纺纤维蛋白原纤维的排列方向，以及接种细胞在纤维排列方向上的取向（B）。（C）仅薄板纤维蛋白原的TEVG横截面的SEM显微照片，其显示定向纤维的同心层（箭头表示相邻的层）。（D）在未补充和TGF-β1补充的TEVG中α-SMA、I型胶原、弹性蛋白和弹性蛋白染色的免疫荧光显微照片。轧制薄板移植物表现出较差的细胞浸润和少量的ECM合成。两组的接种细胞均显示α-SMA和原弹性蛋白的阳性表达。两组均显示阳性的I型胶原蛋白表达，尽管在补充TGF-β1的整个组中更为普遍。两组中主要在细胞化的薄片表面观察到弹性蛋白表达。（E）对弹性蛋白合成的快速测定分析表明，在TGF-β1处理的样品中弹性蛋白含量显著增加（p=0.027）约30％。（F，G）与随机取向的管状TEVG（n=5）相比，添加（n=5）或不添加（n=5）TGF-β1的轧制薄板TEVG的杨氏模量（E）和UTS：TGF-β1补充组显示出显著增加的弹性模量和UTS（p<0.001）。比例尺：B=10µm；C=400µm；D=50µm。

图5.培养4周后，PCL增强的轧制薄板TEVG中的细胞外基质发育。（A）培养4周后PCL增强的轧制薄板TEVG的宏观图像。（B）TEVG横截面的立体光学显微照片（箭头：黑色-PCL层，蓝色-纤维蛋白胶，红色-纤维蛋白原层）。（C）薄片表面的SEM显微照片，显示纤维蛋白原纤维上的定向血管细胞（箭头）。（D，E）在生长培养基中（D）或添加TGF-β1（E）的轧制薄板（+PCL）TEVG中通过移植物壁厚度进行细胞化。（F）细胞核取向的定量显示出高度的细胞局部取向。（G）在整个PCL增强的轧制薄板TEVG中合成的ECM组分的免疫荧光显微照片。未补充和TGF-β1补充的TEVG均显示出支架的广泛基质重塑，如纤连蛋白的大量表达。与I型胶原蛋白染色相比，两组均显示出更高程度的III型胶原蛋白染色，其中TGF-β1补充组的更大面积显示出阳性III型胶原蛋白检测。与轧制薄板（+PCL+TGFβ1补充）TEVG（分别为1.18±0.05、3.35±1.1 MPa和1773±11.9）进行比较（每组n=3），轧制薄板（+PCL）TEVG的UTS（H）、杨氏模量（I）和计算的爆裂压力（J）之间没有显著性差异（分别为1.14±0.03、2.86±0.45 MPa和1712±38.2 mmHg）。比例尺：B=400µm；C=10µm；D，E=100µm；G=50µm。

图6.PCL增强的纤维蛋白原TEVG中弹性纤维相关蛋白（EFRP）合成的定性和定量分析。（A）人脐带动脉、轧制薄板（+PCL）TEVG和轧制薄板（+PCL+TGF-β1补充）TEVG中EFRP和α-SMA表达的免疫荧光显微照片。TEVGs在两组中均显示原弹性蛋白、LOX、原纤维蛋白-1和弹性蛋白的阳性表达，以及4周后接种细胞中α-SMA表达的保留。染色后的TEVG横截面显示出环形富EFRP基质的丰富同心带，两组均对弹性蛋白进行了广泛的阳性染色。（B）α-SMA表达、弹性蛋白和β-肌动蛋白的蛋白质印迹比较。（C）对原弹性蛋白表达的定量表明在补充TGF-β1的移植物中表达显著增加2.01±0.21倍（p＜0.05；n=3）。（D）对α-SMA表达的定量表明在补充TGF-β1的移植物中表达增加了1.73±0.23倍（p＜0.05）。（E）Fastin测定分析显示，补充TGF-β1的移植物中弹性蛋白含量从0.29±0.012降低至0.17±0.02 g/g（每个培养基组n=3）。比例尺：A=50µm。