DOI:10.1021/acsbiomaterials.0c01311

基于细胞系的肝脏模型是进行肝脏相关研究的重要工具。但是，常规的肝细胞单层培养是目前应用最为广泛的体外培养模型，它不具有细胞外基质（ECM），而细胞外基质有助于肝脏中肝细胞的三维（3D）排列。因此，单层组织培养物中肝细胞的代谢特性可能无法准确地反映肝脏中肝细胞的代谢特性。在此，研究者开发了一个模块化平台，用于在由静电纺丝制备的纤维状ECMs上进行3D肝细胞培养，该技术可以将聚合物溶液转变为微纤维/纳米纤维，已被广泛用于生产3D细胞培养的支架。通过液相色谱-质谱（LC-MS）进行的代谢组学定量分析表明，与以单层培养的细胞相比，电纺丝素蛋白微纤维中生长的Huh7肝细胞显示出降低的糖酵解和三羧酸（TCA）循环。进一步的机理研究表明，整联蛋白与ECMs的作用有关。这是首次报道ECM支架是如何通过整联蛋白影响肝细胞基本代谢的。

图1.研究设计。（A）将由丝素蛋白静电纺丝的超细纤维沉积在聚苯乙烯板上，然后将其激光切割成可固定在六孔板中的圆盘。（B）电纺纤维的SEM图。纤维直径为0.78±0.37μm（平均值±标准偏差）。（C）直方图显示了纤维直径的分布。（D）不是直接在孔的底部培养细胞，而是将具有所需ECMs的圆形插入物（例如，纤维状和扁平状）用于细胞培养。

图2.在纤维上和在平板上培养的Huh7细胞中的能量代谢物：糖酵解中的三个关键代谢物和三羧酸（TCA）循环中的五个关键代谢物显著降低，表明能量代谢较低。由于糖酵解消耗减少，葡萄糖水平较高。N=15，误差线=S.E.M.**p<0.01，*p<0.05，n.d.=无显著差异。

图3.（A）β-整联蛋白的蛋白质印迹结果。在平板上培养的细胞具有更多的整联蛋白。（B）定量蛋白质印迹结果（N=7，误差=S.E.M）。（C）细胞内cAMP定量。已知整联蛋白过表达可以降低cAMP水平。此处的数据（N=15，误差=S.E.M.）证实，与纤维上的细胞相比，整联蛋白在平板上的细胞中呈过度表达。（D，E）在纤维上与在平板上培养的细胞的形态。（F）纤维和平板上的细胞的细胞间隙（N=50）。（G）在纤维和平板上测得的孔面积（N=50，误差=S.E.M）。*p<0.025，**p<0.01。

图4.整联蛋白抑制剂RGDS的功效。cAMP是整联蛋白的下游标记，整联蛋白的过度表达会降低细胞内的cAMP。平板上培养的细胞的cAMP显著低于纤维上的细胞，这与本研究中的整联蛋白数据一致。10μg/mLRGDS不能有效地抑制整联蛋白，因为cAMP水平不变。50和100μg/mLRGDS均可增加cAMP，表明整联蛋白具有抑制作用。但是，50μg/mL可使cAMP恢复至与纤维细胞相同的水平，因此被确认为最佳剂量。研究者还测试了阴性对照肽RGES，该肽不能阻断整联蛋白（cAMP没有增加）。N=15，误差线=S.E.M.**p<0.01，n.d.=无显著差异。

图5.使用整联蛋白抑制剂（50μg/mLRGDS），所有检测到的能量代谢物均恢复到与纤维细胞中相同的水平。作为对照，RGES（ctrl肽；50μg/mL）不能发挥作用。N=15，误差线=S.E.M.，*p<0.05，**p<0.025，***p<0.01，n.d.=无显著差异。G-6-P=葡萄糖-6-磷酸；F-1,6-P=果糖-1,6-磷酸；G-3-P=甘油醛-3-磷酸。