DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2020.12.152

功能性肌腱组织工程依赖于利用天然肌腱细胞外基质的生化和生物物理学线索。在本研究中，通过同轴稳定射流静电纺丝法制备了高度定向的聚L-乳酸（PLLA）纤维，其表面修饰有两种重要的肌腱ECM成分，即I型胶原（COL1）和硫酸软骨素（CS）。研究了仿生COL1-CS（壳）/PLLA（核）纤维对人间充质干细胞（hMSCs）体外成肌腱分化的影响。与普通的PLLA纤维相比，在定向COL1-CS/PLLA纤维上观察到了更高的细胞扩散和增殖速率。肌腱相关基因Scleraxis（SCX）和COL1以及蛋白质Tenomodulin（TNMD）的表达显著增加。机械刺激的引入对hMSCs成肌腱分化具有协同作用。在COL1-CS/PLLA纤维基底上观察到细胞中TGF-β2、TGFβR-II和Smad3的更高表达，这表明COL1-CS/PLLA超细纤维可通过激活TGF-β信号通路调控hMSC的成肌腱分化。在大鼠跟腱修复模型中进行的动物研究证实了COL1-CS/PLLA对肌腱组织再生的促进作用。因此，该研究所制备的高度定向仿生纤维可以作为功能性肌腱再生的高效支架系统。

图1.实验设计的流程图。

图2.纤维支架的表征。定向纤维的SEM显微照片：（A）非交联COL1-CS/PLLA（插图为TEM图像，显示带有白色虚线的核-壳结构）和（B）PLLA。分析纤维支架和天然大鼠跟腱的拉伸特性，包括典型的应力-应变曲线（C），拉伸强度（D），杨氏模量（E）和断裂应变（F）。**p＜0.01，n≥3。

图3.（A，B）培养3天后，通过鬼笔环肽染色在定向COL1-CS/PLLA（A）和PLLA（B）纤维支架上的hMSCs细胞骨架。比例尺=100μm。（C）在不同纤维支架上培养的hMSCs的面积和半径比。（D）通过MTS测定分析在不同纤维支架上培养的hMSCs的细胞增殖。**p＜0.01，***p＜0.001，n=3。

图4.在培养的第3天和第10天通过RT-PCR测定肌腱相关标志物SCX、TN-C、COL1和COL3，骨相关标志物RUNX2和TGF-βs（TGF-β1，TGF-β2和TGF-β3）的mRNA转录产物表达水平。在第4天至第10天期间施加机械刺激。*p＜0.05，**p＜0.01，n=3。

图5.（A）在培养的第3天和第10天，在PLLA和COL1-CS/PLLA纤维支架上用DAPI染色的细胞核（蓝色）对hMSCs中的TNMD（绿色）进行免疫荧光标记。（B）在培养的第3天和第10天，PLLA和COL1-CS/PLLA纤维支架上TNMD阳性细胞的百分比。在第4天至第10天期间施加机械刺激。*p＜0.05，**p＜0.01，n=6，比例尺=100μm。（要解释此图例中对颜色的引用，请参阅本文的网络版本。）

图6.（A）通过全细胞裂解物的蛋白质印迹分析hMSCs的TGF-β信号分子（±表示有/没有COL1-CS涂层），（B）用含或不含TGFβR-II抑制剂的LY2109761处理的COL1-CS/PLLA上细胞蛋白质提取物的蛋白质印迹分析。

图7.（A）造成了一道伤口缝并移除跟腱，以产生6mm长的缺损。将支架放置在肌腱缺损处并缝合。（B）术后4或8周，修复部位的正常对照（右图为左图方框区的高倍放大）、PLLA和COL1-CS/PLLA的典型H＆E染色。比例尺=50μm，“正常”是指天然的大鼠跟腱。

图8.植入8周后，来自再生肌腱的肌腱相关基因的mRNA转录水平。*p＜0.05，**p＜0.01，n=6，“正常”是指天然的大鼠跟腱。

图9.（A）术后8周，正常对照、PLLA和COL-CS/PLLA中表达的特殊蛋白（Col1，Col3）的免疫组织化学染色。比例尺=50μm。（B）再生8周后修复肌腱的力学性能。*p＜0.05，**p＜0.01，n≥3，“正常”是指天然的大鼠跟腱。

图10.所提出的机理模型表明，COL1-CS/PLLA纤维增加了内源性TGF-β2的产生，激活TGF-β信号上调SCX的表达，从而增加了hMSCs的腱鞘生成。