DOI: 10.1002/adhm.202001832

本文报道了一种通过结合合成生物学和材料化学来制备可调多功能生物材料的新途径。基因编码的儿茶酚部分在具有定义面和次级反应性功能化学的纳米纤维垫中进化，这促进了蛋白质的自组装和湿粘附特性。儿茶酚部分被进一步用于硼酸的控制释放，其提供了有利的细胞微环境以促进伤口愈合。纳米纤维垫中3,4-二羟基苯丙氨酸的存在可以刺激细胞增殖、迁移和血管形成，从而加速伤口愈合。电子顺磁共振、NMR、FTIR和圆二色性光谱证实了结构完整性、抗氧化性和硼酸的受控释放。荧光和扫描电子显微镜揭示了纳米纤维垫的3D结构，有利于成纤维细胞生长、内皮细胞附着和管形成，这是伤口愈合材料的理想特性。在小鼠伤口愈合模型中进行的动物研究表明，多功能生物材料显著改善了再上皮化并加速了伤口闭合。

图1.A）GFP和GFPDOPA（20µm）的EPR光谱分析，次黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶体系在pH7.4的50mM磷酸盐缓冲液、0.5mM DTPA和50mM DEPMPO中产生了超氧化物（O2•-）自由基。B）用PVA，GFP纳米纤维（8:1）（1，5），GFPDOPA纳米纤维（8:1）（2，6），GFP纳米纤维（8:2）（3，7）和GFPDOPA纳米纤维（8:2）（4，8）增强的蛋白质纳米纤维的荧光显微镜和SEM图像。C）PVA、GFP和GFPDOPA的ATR-FTIR光谱（1000-4000cm-1）。D）测量涂覆在聚苯乙烯（1，4），聚丙烯（2，5）和石英板（3，6）上的GFP（1-3）和GFPDOPA（4-6）的接触角。

图2.A）PVA、GFP和GFPDOPA纳米纤维垫的DPPH清除效率。B）相对的细胞内ROS荧光强度，由三个独立实验计算得出（n=3）。所有数据均表示为平均值±SD。与对照组、PVA和GFPDOPA相比具有统计学显著性（n=3，*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001）。在PVA、GFP和GFPDOPA纳米纤维垫上48h时细胞增殖的荧光显微图像。C）EA.hy926和D）3T3-NIH内皮细胞在不同时间点的增殖。E）在PVA、GFP和GFPDOPA纳米纤维垫上生长48小时的成纤维细胞（NIH-3T3）的SEM图像。

图3.A）GFPDOPA纳米纤维垫处理后，内皮细胞的细胞增殖标志物的相对基因表达分析。B）在不同时间点EA.hy926内皮细胞的体外伤口愈合测定。C）PVA、GFP和GFPDOPA增强垫上内皮细胞的相对划痕间隙百分比。所有数据均表示为平均值±SD，与对照组、PVA和GFPDOPA相比具有统计学显著性（n=3，*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001）。

图4.A）EA.hy926内皮细胞系在不同时期的血管生成量。用PVA、GFP和GFPDOPA纳米纤维垫处理的EA.hy926内皮细胞系。B）GFPDOPA管形成的节点、管和接头的定量图像。C）用PVA和GFP以及GFPDOPA纳米纤维垫处理的Wistar大鼠主动脉环细胞第9天的血管新生（5×图像）。阴性对照：仅DMEM（1），阳性对照：VEGF（2）和明胶（3），测试：PVA（4），GFP（5），GFPDOPA（6），纳米纤维垫。D）用PVA、GFP和GFPDOPA纳米纤维垫处理的内皮细胞系（EA.hy926）的相对血管生成基因表达谱。所有数据均表示为平均值±SD，与对照组、PVA和GFPDOPA相比具有统计学显著性（n=3，*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001）。E）GFPDOPA和F）GFPDPBA的MALDI-TOF分析。G）11B-NMR光谱表明GFPDOPA和硼酸在中性pH值之间存在共轭。H）PVA、GFP、GFPDOPA和GFPDPBA在不同pH（6、6.5和7.4）下的抗菌作用。I）对PVA、GFP、GFPDOPA和GFPDPBA纳米纤维垫的抗血性能分析。

图5.用纱布（对照）、PVA、GFP、GFPDOPA和GFPDOPA-硼酸纳米纤维垫处理的全层切除伤口在不同时间点（n=6）的闭合率。

图6.A）用不同纳米纤维材料包扎伤口后第5、10、15和20天的伤口闭合百分比，与对照相比，GFPDOPABA具有统计学显著性。所有数据均以平均值±SD表示（n=6，*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001）。

图7.A，C）用纱布、PVA、GFP、GFPDOPA和GFPDPBA处理的大鼠皮肤组织（n=6）的苏木精-伊红染色。B，D）（用纱布、PVA、GFP、GFPDOPA和GFPDPBA纳米纤维垫处理的皮肤组织）的Masson三色染色（蓝色表示胶原蛋白的分布）。E）使用细胞角蛋白AE1/AE3免疫染色来鉴定第20天的完整再上皮化（深棕色表示完全再上皮化）。GT-肉芽组织；SGT-少肉芽组织；MGT-轻度肉芽组织；D-真皮；E-表皮；BV-血管；HF-毛囊。