DOI: 10.1016/j.actbio.2021.01.035

纳米纤维支架因其模拟细胞外基质（ECM）结构而在组织工程中具有广阔的应用前景。静电纺丝技术因其易于制备纳米纤维支架而被广泛应用于各种组织工程领域。然而，当采用常规的支架制备方法和随后的细胞接种时，由于这些支架中互连孔的尺寸较小，因此电纺纳米纤维支架面临着三维（3D）细胞分布的固有挑战，这严重限制了它们在具有厚壁血管化结构的人体组织修复/再生中的应用。在这项工作中，研究者演示了一种通过同时进行乳液静电纺丝和同轴细胞电喷涂将活的内皮细胞直接置于3D生物活性纳米纤维支架内的方法。使用这种并行制造方法，将内皮细胞封装在水凝胶微球中，并在支架制造过程中与含血管内皮生长因子（VEGF）的纳米纤维一起沉积，从而形成具有3D嵌入式细胞封装微球的纳米纤维支架。在选择性破坏水凝胶微球后，释放出封装的内皮细胞，从而产生具有组织样3D细胞嵌入纳米纤维结构的生物活性纳米纤维支架。结果表明，在并行制造过程中，细胞存活率保持良好（>98％），并且在整个支架厚度上实现了深度细胞分布（约100μm）。3D细胞嵌入式架构结合了结构和生化线索，内皮细胞可以自由拉伸，显示出增强的细胞间连接，维持了生物活性纳米纤维支架的表型。综上，本研究为构建具有3D细胞掺入的生物活性纳米纤维支架和克服电纺纳米纤维支架的固有问题提供了一种很有前途的平台技术，这将为生物制造具有血管化结构和复杂解剖结构的仿生组织开辟了新的途径。

图1.示意图显示了并行的乳液静电纺丝和同轴细胞电喷涂工艺，该工艺首先制备嵌入有细胞封装微球的纳米纤维支架，随后在微球释放封装细胞后制备出掺入3D细胞的纳米纤维支架。

图2.通过同轴细胞电喷雾将内皮细胞封装在海藻酸钙水凝胶微球中。（A）以低细胞密度形成细胞封装海藻酸钙微球，通过使用LIVE/DEAD细胞生存力试剂盒对封装细胞进行染色。（B）以高细胞密度形成细胞封装海藻酸钙微球，其中通过使用LIVE/DEAD细胞生存力试剂盒对封装细胞进行染色。（C）以不同细胞密度形成的海藻酸钙微球的平均直径。（D）以低细胞密度形成的细胞封装海藻酸钙微球，其中封装细胞分别用DAPI和DCFDA染色以标记细胞核并探测细胞内ROS水平。（E）以高细胞密度形成的细胞封装海藻酸钙微球，其中封装细胞分别用DAPI和DCFDA染色以标记细胞核并探测细胞内ROS水平。（F）以不同细胞密度形成的海藻酸钙微球中封装细胞的活力。（G）以不同细胞密度形成的海藻酸钙微球中具有高细胞内水平的细胞百分比。（H）以不同细胞密度形成的单个细胞封装海藻酸钙微球的细胞数量。（I）以不同细胞密度形成的海藻酸钙微球的细胞包封能力。

图3.海藻酸钙微球按需释放内皮细胞以及所释放细胞的活性。（A）细胞释放处理后，海藻酸钙微球的结构随时间的变化。（B）培养12小时后，分别用DAPI和DCFDA染色释放的内皮细胞，以标记细胞核并探测细胞内ROS水平。（C）分析培养12小时后释放细胞和人工接种细胞（对照）中每个细胞的DCFDA平均强度。（D）通过使用LIVE/DEAD细胞生存力试剂盒对在培养时间内释放的内皮细胞进行染色。（E）在不同培养时间后分析释放细胞的活性。（F）分析不同培养时间后释放细胞的细胞密度。

图4.通过同时乳液静电纺丝和同轴细胞电喷雾制备的支架的形态、结构、力学性能和VEGF释放曲线。（A）通过并行制造工艺制备的嵌入微球的支架的形态和结构。（B）通过并行制造和随后的细胞释放处理制备的3D细胞掺入支架的形态和结构。（C）比较正常PLGA支架，微球嵌入式支架和3D细胞掺入支架的极限拉伸强度。（D）比较正常PLGA支架，微球嵌入式支架和3D细胞掺入支架的断裂应变。（E）乳液电纺PLGA纳米纤维的核-壳介观结构。（F）乳液电纺PLGA支架中VEGF的体外累积释放曲线。

图5.通过同时乳液静电纺丝和同轴细胞电喷雾制备的生物活性纳米纤维支架中内皮细胞的活性、分布、形态和细胞骨架发育。（A）HUVECs在微球嵌入支架中的生存力和分布（通过使用LIVE/DEAD生存力试剂盒染色），并在并行制造过程之后立即进行细胞染色。（B）HUVECs在3D细胞掺入支架中的生存力和分布（通过使用LIVE/DEAD生存力试剂盒染色），在并行制造过程和细胞释放处理后立即进行细胞染色。（C）代表性LSCM图像，显示细胞培养1天后3D细胞掺入支架内HUVECs的3D分布（以钙黄绿素AM标记）。（D）细胞培养1天后3D细胞掺入支架的形态，白色箭头表示3D纳米纤维结构中的内皮细胞充分拉伸。

图6.在释放VEGF的2D细胞掺入、无VEGF的3D细胞掺入和释放VEGF的3D细胞掺入支架上或中培养的内皮细胞的细胞骨架发育和表型。（A）细胞培养3天后，在纳米纤维支架上或中生长的内皮细胞的细胞骨架发育（无VEGF或释放VEGF），白色箭头指示形成的细胞间连接。（B）细胞培养5天后，在纳米纤维支架上或中生长的内皮细胞的形态和表型（无VEGF或释放VEGF）。