DOI: 10.1002/adfm.202008732

具有抗肿瘤和组织修复功能的新型生物材料在黑色素瘤术后护理中变得越来越重要，它可以延长患者的无瘤生存期，同时促进创伤组织的重建。为此，本研究设计了一种生物可吸收复合支架，该支架是通过静电纺丝将基于治疗性无定形碳酸钙（ACC）的纳米制剂沉积在明胶/聚己内酯（GP）纳米纤维中制成的。ACC纳米制剂与Fe2+预活化的博来霉素结合，以提供生物催化增强的治疗效果，而可水解的ACC内容物可充当质子清除剂，以改善肿瘤组织酸性，从而持续抑制肿瘤的复发和转移。酸触发的ACC分解也释放Ca2+，以活化下游Wnt/β-catenin信号通路，其可与GP底物的愈合作用产生协同效应并加速伤口再生。综上，纳米工程支架可以作为黑色素瘤术后治疗的辅助手段。

图1.ACC@Fe2+/BLM-CaSi-GP支架的合成过程及其对同时进行黑色素瘤治疗和伤口愈合的互补能力。

图2.样品的物理表征。图（a）和（b）为Fe2+-BLM负载ACC基纳米样品（a：ACC@Fe2+/BLM，b：ACC@Fe2+/BLM-CaSi）的TEM图像，图（c）为ACC@Fe2+/BLM-CaSi的SAED图谱。图（d）和（e）为不同支架在不同放大倍率下的SEM图像（d：GP，e：ACC@Fe2+/BLM-CaSi-GP）。图（f）是ACC@Fe2+/BLM-CaSi-GP的TEM图像。图（g）是基于ACC@Fe2+/BLM-CaSi-GP扫描透射电子显微镜分析的元素映射结果。

图3.支架的药物释放动力学和细胞作用。a）通过UV-vis吸光度测量从SBF中的ACC@Fe2+/BLM-CaSi-GP释放BLM的动力学。图（b）和（c）通过ICP分析得出Ca离子和Fe物种的释放曲线。图（d）显示了在不同支架上孵育3天后，HaCat细胞中Ca2+分布的CLSM基分析（I：对照，II：GP，III：ACC-CaSi-GP，IV：ACC@BLM-CaSi-GP，V：ACC@Fe2+/BLM-CaSi-GP）。图e（I-IV）显示了在不同支架上孵育3天后的HaCat细胞的形态变化（I：GP，II：ACC-CaSi-GP，III：ACC@BLM-CaSi-GP和IV：ACC@Fe2+/BLM-CaSi-GP）。f）通过CLSM观察在不同支架上孵育3天后的HaCat细胞的形态变化（I：对照，II：GP，III：ACC-CaSi-GP，IV：ACC@BLM-CaSi-GP，V：ACC@Fe2+/BLM-CaSi-GP）。蓝色、红色和绿色分别代表细胞核、F-肌动蛋白和肌球蛋白。

图4.支架在体外的生长抑制作用。a）在不同支架上生长48小时后，B16F10细胞中细胞内羟基自由基水平的变化。b）用各种支架处理48小时后，B16F10细胞中DNA断裂严重程度的DNA阶梯分析。c）通过CLSM观察B16F10细胞在不同支架上生长48小时后细胞内羟基自由基的分布（I：对照，II：GP，III：ACC-CaSi-GP，IV：ACC@BLM-CaSi-GP，V：ACC@Fe2+/BLM-CaSi-GP）。d）通过流式细胞术分析接种于不同支架后B16F10细胞的凋亡水平。e）用各种支架处理48小时后B16F10细胞凋亡的CLSM分析（I：对照，II：GP，III：ACC-CaSi-GP，IV：ACC@BLM-CaSi-GP，V：ACC@Fe2+/BLM-CaSi-GP）。蓝色表示细胞核，而红色表示细胞膜。

图5.治疗诱导黑色素瘤体内抑制作用的评估。a）比较不同治疗组中肿瘤大小的视觉照片。用不同支架对B16F10荷瘤小鼠进行15天的治疗，然后收集肿瘤以进行成像。b）对不同治疗后肿瘤体积变化的统计分析（*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001）。c）治疗15天后不同组肿瘤重量的统计分析。d）不同组小鼠体重变化的统计分析。e）不同组肿瘤组织样品的H＆E和TUNEL染色结果（I：对照，II：GP，III：ACC-CaSi-GP，IV：ACC@BLM-CaSi-GP和V：ACC@Fe2+-BLM-CaSi-GP）。

图6.治疗诱导黑色素瘤转移抑制作用的评估。a）使用ANNA探针（I500/I540）获取经不同支架治疗后的B16F10荷瘤小鼠的肿瘤部位荧光图像和局部pH。b）经不同支架治疗后B16F10荷瘤小鼠肺转移结节的图像（I：对照，II：GP，III：ACC-CaSi-GP，IV：ACC@BLM-CaSi-GP，V：ACC@Fe2+/BLM-CaSi-GP）。c）通过免疫印迹分析经不同治疗后B16F10荷瘤小鼠中关键转移标志物（包括PDL，P-p38，NF-Kb和MMP-9）的表达水平（I：对照，II：GP，III：ACC-CaSi-GP，IV：ACC@BLM-CaSi-GP，V：ACC@Fe2+/BLM-CaSi-GP）。d）通过免疫荧光成像评估经不同治疗后B16F10荷瘤小鼠中MMP-9（绿色）的表达（I：对照，II：GP，III：ACC-CaSi-GP，IV：ACC@BLM-CaSiGP，V：ACC@Fe2+/BLM-CaSi-GP）。蓝色显示细胞核。

图7.支架生物降解及创面再生的体内评估。a）经不同支架治疗后，糖尿病小鼠中伤口修复率的摄影图像。b）第15天，对糖尿病小鼠关键伤口愈合标志物（包括Wnt5a，β-catenin，Keratin-1和Loricrin）的表达进行蛋白质印迹分析。第0天用不同支架治疗的小鼠（I：对照，II：GP，III：ACC-CaSi-GP，IV：ACC@BLM-CaSi-GP，V：ACC@Fe2+/BLM-CaSi-GP）。c）体内孵育不同天数后，ACC@Fe2+/BLM-CaSi-GP支架形态变化的SEM图像。（d）第15天在糖尿病小鼠伤口组织中的Wnt5a、β-catenin、Keratin-1和Loricrin表达水平的免疫组织化学图像。（I：对照，II：GP，III：ACC-CaSi-GP，IV：ACC@BLM-CaSi-GP和V：ACC@Fe2+/BLM-CaSi-GP）（*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001）。

图8.复合支架的伤口愈合功效和作用机理。a）15天治疗后，通过CD31免疫荧光研究糖尿病小鼠伤口血管新生的情况。覆盖不同支架的伤口（I：对照，II：GP，III：ACC-CaSi-GP，IV：ACC@BLM-CaSi-GP和V：ACC@Fe2+/BLM-CaSi-GP）。图（b）和（c）为上述5个治疗组的伤口组织标本的H＆E和Masson三色染色结果。d）生物可吸收支架的分子机制增强了治疗效果，以防止黑色素瘤复发和转移，同时加速了手术伤口的愈合。