DOI: 10.1021/acsami.2c16126

三维（3D）生物打印使复杂组织模拟结构的自动化制造成为可能，这就需要开发不仅具有可打印和生物相容性，而且集成细胞指导特性的生物墨水。为此，本研究提出了一种可扩展技术，用于生成具有独特组织引导功能的纳米纤维3D打印油墨。该核心方法依赖于通过溶剂控制的部分羧甲基化来调整纤维素纤丝的尺寸和分散性。通过这种方式，生成了部分带负电的纤维素纳米纤维，其直径约为250nm，长度为几十到几百微米。在这个范围内，纤维在结构上与天然胶原纤维的规格及几何尺寸相匹配，使其足够大以引导细胞。然而，它们同时又足够薄，呈现出光学透明度。通过调整纤维浓度，可以建立具有优异剪切稀化特性的3D打印油墨。此外，由于纤维易于分散，可以很容易地生成含有碳水化合物和细胞外基质（ECM）衍生蛋白质的复合油墨。将这种复合油墨应用于3D打印细胞负载可交联结构，以及组织引导凝胶基质。有趣的是，研究发现工程组织的空间结构可以通过打印过程中剪切诱导纤维排列来定义。本研究展示了如何在具有中间纤维含量的软印刷基底上将源自人类和小鼠骨骼肌成肌细胞的肌管编程为线性和复杂的非线性结构。因此，纳米纤丝纤维素油墨可以作为一种简单且可扩展的工具，用于构建模拟天然结构和功能的各向异性人体肌肉组织。

图1.MFC在不同溶剂组成中的羧甲基化：DSrel和透射率的比较。（a）MFC羧甲基化反应机理。增加反应程度会增加取代纤维的透明度。（b）MFC在0:1、1:2、1:1、2:1和1:0 IPA:EtOH中反应的FT-IR。用于计算取代度（rel）的标准化吸光度。（c）在2.5:1 NaOH:AGU/1:1 MCA:AGU的相应IPA:EtOH混合物中反应的1%w/v纤维水分散体的照片。（d）基于2.5:1 NaOH:AGU/1:1 MCA:AGU的IR数据计算的400nm下1%w/v分散体的透射率（%）和DSrel。（e）通过纤维滴定计算的取代度。误差条表示平均值的标准误差（SEM），n=3。

图2.通过SEM分析羧甲基化纤维的尺寸和外观。（a）随着反应程度的增加，纤维断裂的图示。纤维在（b）0:1、（c）1:2、（d）1:1、（e）2:1和（f）1:0 IPA:EtOH中反应的SEM图像。比例尺：50μm。（g）以纳米为单位的平均纤维宽度和SEM，n=100；基于同一样本的不同视野进行计算。

图3.1%羧甲基化纤维在milliQ水中的流变特性和印刷性能。（a）MFC的储能模量G’和损耗模量G”；在（b）0:1、（c）1:2、（d）1:1、（e）2:1和（f）1:0 IPA:EtOH中官能化的纤维。在milliQ水中，以1Hz的频率记录25℃下的振荡扫描。（g）用2%MFC、2%cNFC 0:1、2%cNFC 1:2、2%cNFC 1:1、2%cNFC 2:1和2%cNFC 1:0，经钢针（ID 400μm）打印的DTU徽标的光学外观和打印。比例尺=1cm。

图4.更高浓度下cNFC 2:1的流变特性、透射率和印刷性能。（a）1%cNFC 2:1、（b）3%cNFC 2:1和（c）5%cNFC 2:1的储能模量G’和损耗模量G”。在milliQ水中，以1Hz的频率记录25℃下的振荡扫描。当milliQ水中含（d）1%、（e）3%和（f）5%cNFC 2:1时DTU徽标的可打印性。比例尺=1cm。（g）1%振荡应变下的储能G’和损失G”模量随cNFC 2:1浓度的增加而发生变化。（h）400nm处的透射率（%）随着milliQ水中cNFC 2:1浓度的增加而发生变化。

图5.可交联cNFC:藻酸盐复合油墨的流变特性和3D打印。（a）3%藻酸盐、（b）3%MFC+3%藻酸盐复合油墨和（c）5%cNFC 2:1+3%藻酸盐复合油墨的储能模量G’和损失模量G”。在milliQ水中，以1Hz的频率记录25℃下的振荡扫描。（d）并排比较用3%MFC+3%藻酸盐和5%cNFC 2:1+3%藻酸盐复合油墨印刷的章鱼雕像（比例尺=1cm）。

图6.交联前后cNFC:明胶复合油墨的流变特性和硬度。在Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中，以1Hz的频率记录25℃下的振荡扫描。（a）5%明胶+5%cNFC、（b）0%明胶+5%cNFC和（c）5%明胶+0%cNFC复合油墨的流变特性。（d）细胞指导性涂层印刷：随后在4℃下用mTG交联基材过夜。（e）用5%明胶+5%cNFC、5%明胶+0%cNFC和0%明胶+5%cNFC复合油墨印刷的交联基材的杨氏模量E（kPa）。根据1%振荡应变下的G’计算E和SEM，n=3。

图7.C2C12在cNFC:明胶基质上的自对准。（a）C2C12肌肉细胞接种到交联印刷基板上的图示。（b）接种细胞的多核肌管在印刷基底上分化。白色：肌动蛋白；蓝色：细胞核。比例尺：50μm。（c）用OrientationJ对肌管（肌动蛋白）取向进行伪彩色映射。比例尺：500μm。（d）与5%LBG+5%cNFC相比，5%LBG上C2C12肌管对齐的分数（0-1）。（e）以类似棋盘的方式打印水平和垂直线交替块，以及带有接种细胞交替方向的15mm×15mm伪彩色棋盘。比例尺：5mm。（f）r=3.5mm的同心圆打印以及细胞呈圆周取向的伪彩色打印。比例尺：5mm。

图8.人骨骼肌细胞（HSkMs）在印刷的cNFC:明胶基质上的自对准。（a）根据打印方向对齐HSkM。用钢喷嘴（ID 250μm）以圆周运动的方式印刷基板：4%明胶（左）和4%LB明胶+4%cNFC（右）。白色：肌动蛋白染色。比例尺：1.5mm。（b）在4%LB明胶和4%LB明胶+4%cNFC上对齐的人肌管的对齐分数（0-1），n=3。