DOI:10.1002/adhm.202300719

心脏安全性评估对药物开发具有重要意义，药物的心肌毒性（DIC）是导致新药研发失败的重要原因之一。尽管心肌器官芯片（HoC）技术已成为评估DIC的一种越来越流行的工具，但由于天然心肌层的各向异性心肌结构，其发展仍然是一个挑战。在此，通过3D打印与静电纺丝技术相结合的混合生物制造方法，设计出一种各向异性的多尺度心肌支架，其中3D打印的微米级支架框架能够模拟交织的心肌解剖结构，并且分支取向电纺纳米纤维网络能够定向引导细胞排列。然后，通过将三层多尺度支架封装在可光固化的甲基丙烯酸明胶水凝胶壳内，制备体外3D生物工程心肌组织。研究表明，这种各向异性的多尺度结构有助于增强心肌细胞的成熟和同步搏动行为。更吸引人的是，本研究通过整合3D生物工程心肌组织和自行设计的微流体灌注系统，建立了一个3D各向异性HoC平台，用于评估DIC和心肌保护效果。总之，上述结果表明，通过整合3D生物工程心肌组织开发的HoC模型可以有效地概括临床表现，从而突出其作为测试药物疗效和心肌毒性的宝贵临床前平台的功效。

图1.设计和制备模拟天然心肌组织结构的支架。a）示意图显示了具有交织结构的定向细胞层从心内膜到心外膜的逐渐过渡。b）3D打印结合静电纺丝技术制备多尺度各向异性支架，并进一步将工程心肌组织与微流控芯片相结合，作为药物研究的心肌器官芯片平台。

图2.设计和制备模拟天然心肌组织结构的支架。a）通过3D挤压打印制备的宏观支架的示意图。印刷柱的直径标记为D，两个相邻平行柱之间的空间标记为S。b）微米级支架的总成像。c）不同直径和空间的微米级支架的实际尺寸统计。d）微米级支架的SEM图像。e）在微米级支架表面静电纺丝的示意图。f）多尺度支架的总成像和纳米纤维的SEM图像。多尺度支架的总成像和SEM图像显示了不同的定向微观结构。g）不同支架条件下纳米纤维的实际尺寸统计。h）多尺度支架的SEM图像和纳米纤维净排列方向的统计分析。i）聚多巴胺涂覆多尺度支架的示意图。j）使用多巴胺自组装涂覆的支架的总成像。k）PDA涂层前后的水接触角（*P<0.05）。

图3.在具有不同直径和空间的多尺度支架上培养CMs。a）接种在多尺度支架上的CMs的示意图。b）活/死图像显示CMs可以在多尺度支架上正常生长。c）通过活/死分析评估多尺度支架上CMs的细胞活力百分比。d）培养五天后，通过F-肌动蛋白（绿色）和DAPI（蓝色）染色获取多尺度支架上CMs的共聚焦图像，细胞取向分布的定量分析表明，细胞与分支定向纳米纤维的方向一致。e）细胞伸长的统计数据是使用细胞核长径比估算的（TCP组与其他组相比，*P<0.05）。f）多尺度支架上排列在-10°至10°范围内的细胞百分比（4D4S组与其他各组相比，*P<0.05）。g）多尺度支架上排列在80°至100°范围内的细胞百分比（4D4S组与其他各组相比，*P<0.05）。

图4.不同直径和空间的多尺度支架上的CMs表型。a）肌节α-肌动蛋白（绿色）、CX43（红色）和细胞核（蓝色）的免疫荧光染色显示，多尺度支架上的心肌组织（培养5天）和（b）2D对照组的心肌组织在表型上不同。c）α-肌动蛋白在不同直径和空间的多尺度支架上和在2D上的相对面积百分比的定量分析（TCP组与其他组相比，*P<0.05）。d）CX43在支架和2D组上的相对区域（百分比）的定量分析（TCP组与其他组相比，*P<0.05）。e）培养5天后，支架组不同区域CMs的搏动行为。

图5.3D混合支架的制备和在这些3D支架内的CM培养。a）心脏标本显示定向细胞层从心内膜向心外膜逐渐过渡。b）随着取向的逐渐转变，多层多尺度支架的组装示意图。c）随着取向的逐渐转变，组装的多层多尺度支架的大体和（d,e）SEM图像。f）将CMs接种在多尺度支架一层上，以及（g）光交联后在GelMA水凝胶壳内封装三层逐渐过渡的多尺度支架来制备3D支架的过程示意图。h）三层3D支架的大体和（i）免疫荧光染色图像。j）F-肌动蛋白/DAPI染色细胞共聚焦图像的顶视图和3D视图以及细胞取向的统计数据。

图6.心肌器官芯片的设计和制备。a）心肌组织微流控芯片的设计示意图。b）心肌器官芯片的设计示意图。c）监测生物工程心肌组织活动的示意图。d）心肌器官芯片的大体图像。e）通过灌注培养获得的心肌器官芯片的大体图像。f）监测生物工程心肌组织活动的大体图像。g）整个芯片系统的示意图，包括主芯片、介质储存器、蠕动泵和监测模块。h）芯片系统的大体图像。该示意图模拟了（i）液体流速和（j）芯片中支架表面的静压。k）芯片内部可视化流量分布的示意图。（l）未灌注和（m）灌注芯片的CMs的活/死显微照片。n）通过活/死分析评估CMs的细胞活力百分比（*P<0.05）。

图7.使用3D各向异性支架和心肌器官芯片的药物诱导心肌毒性和心肌保护作用。a）三维多尺度支架心肌毒性评估的时间线。b）2D对照和3D多尺度支架上ROS的免疫荧光染色。c）2D对照和3D支架上ROS覆盖的相对面积（百分比）的定量分析（*P<0.05）。d）心肌器官芯片毒性评估的时间线。e）在芯片和2D对照上，计数24小时内DOX+/DEX-组、DOX+/DEX+组和DOX-/DEX-组的CMs搏动频率。f）通过活/死测定评估不同组CMs的活力（*P<0.05）。g）在芯片上培养5天后，肌节α-肌动蛋白（绿色）、CX43（红色）和细胞核（蓝色）的免疫荧光染色。h）芯片上α-肌动蛋白面积覆盖的相对百分比的定量分析（*P<0.05）。